sábado, 12 de abril de 2008

BIOQUÍMICA - 1º Bimestre (Parte III)

MÉTODOS ANALÍTICOS:

- Fotometria: à Espectofotometria;

à Fotometria de chama;

- Eletroforese;

- Cromatografia.

Fotometria:

Seu principio é a medida ou quantificação da luz, ou seja, usa-se a medida da luz para quantificar soluções.

Luz à energia que se propaga na forma de ondas e está na região do visível. (Região do visível: 380nm ---luz--- 750nm). Abaixo de 380nm nos não enxergamos mais nada, é o UV, e acima de 750nm é o IF.

Na bioquímica trabalha-se mais com regiões abaixo de 380nm, principalmente as dosagens enzimáticas (dosa formação de NADH que é 340nm).

Trabalha-se com faixas estreitas de comprimento de onda, dentro da região do visível, mas com intervalos pequenos dos comprimentos de onda. Portanto, na hora de comprar um espectofotometro, comprar um com as faixas de ondas mais separadas estreitamente. Para as separações das cores das faixas estreitas eu posso usar um prisma ou um filtro. O que usa filtro é chamado de fotômetro de filtro e o que usa prisma é o espectofotometro.

- Espectofotometro:

Transmitância: quantidade de luz transmitida por uma solução. Reduz conforme a concentração da solução aumenta.

Absorbância: quantidade de luz absorvida por uma solução. É mais exata que a transmitância e é proporcional a concentração de forma linear.

É difícil usar a transmitância para cálculos de concentração porque ela não tem uma variação linear, isto por causa da dispersão da luz.

Lei de Lambert Beer: A absorbância aumenta proporcionalmente à concentração.

Abs: a . b . c

Onde: a = característica da solução dosada.

B = constante; caminho óptico (largura da cubeta)

C = concentração da solução.

Linearidade: indica que a variação na absorbância é proporcional na variação da concentração. Se eu dobro a Abs, dobra a [] e assim por diante. Porem, chega a um ponto em que o método sai de linearidade acontecendo que a [] continua a aumentar mas a abs permanece estável. A dosagem só é linear de 70mg/dL a 500mg/dL.

Quando perco a linearidade de uma dosagem acima de 500mg/dL é preciso diluir a solução para a concentração diminuir e assim a dosagem continua linear, depois de terminar a dosagem pego o resultado e multiplico pelo fator de diluição para obter o resultado real.

Se tenho uma solução abaixo de 70mg/dL deve-se fazer a recuperação:

- usa-se uma soluçai padrão (este vale 100mg/dL), então eu coloco uma quantidade do meu padrão na solução que quero dosar. Ex: no resultado final eu tenho 145mg/dL, portanto a minha dosagem será de 45mg/dL, pois tenho que calcular sem o padrão.

Comprimento de onda específica: Para cada solução tem um pico de absorção máxima, que é o comprimento de onda que tenho que deixar para ter a absorção máxima da luz pela solução.

Se eu uso um comprimento de onda fora do ideal a abs será menor e a concentração não vai dar o resultado certo para minha analise.

Fendas e monocromador devem estar no mesmo nível, ou seja, o aparelho deve estar em uma superfície plana. O volume que vai na cubeta não pode ser muito baixo pois a luz pode passar direto para o detector sem passar pela substancia, dando um resultado de [] muito alto que não é verídico, portanto o volme da cubeta deve ser ajustado proporcionalmente ao nível do monocromador e da fenda.

- Fotometria de Chama:

Mais usada para dosagens de sódio e potássio, embora também sirva para dosar cálcio, lítio, magnésio, etc.

Baseia-se na capacidade que um composto tem em absorver energia térmica e emitir essa energia em forma de luz com comprimentos de ondas específicos.

Todas as substancias medidas tem em comum que são carregadas positivamente, ou seja, falta de elétrons (os elétrons estão na ultima camada analítica, quando são excitados pelo calor eles migram de camadas emitindo luz).

A água que vai no neutralizador deve ser deionizada porque os íons podem alterar o resultado. Em seguida coloco o padrão. Depois coloco água de novo, caso o padrão não se ajuste, e faço isso até ajustar.

- Eletroforese:

Seu principio é identificar e quantificar substancias através da migração diferencial quando submetidas a um campo elétrico.

O que interfere na migração do campo elétrico::: meio/suporte; tamanho da molécula (PM); intensidade do campo; intensidade de carga elétrica (i).

Na bioquímica é usada para dosagem de proteínas plasmáticas e hemoglobina.

- Cromatografia:

Seu principio é identificar e quantificar baseado na afinidade do analito por uma fase móvel ou uma fase fixa.

A fixa é configurada em duas partes:::

- Cromatografia plana: ou é de papel ou de camada delgada (placa de vidro);

- Cromatografia em coluna: quando usa um suporte e a fase fixa fica presa la dentro.

A fase móvel é dividida em liquida e gasosa.

HPLC à cromatografia liquida de alta eficiência.

Tipos de cromatografia:

- Exclusão

- Troca iônica

- Afinidade

- Absorção (usada apenas para pesquisa)

Por exclusão: separa substancias com base no peso molecular à usa-se uma resina com poros diferentes e joga a substancia com moléculas de vários PM, as que tem maior PM saem primeiro, pois os poros grandes são retos, e as menores ficam “dando voltas” nos poros menores até saírem.

Por troca iônica: usa a carga elétrica para separar, usada para dosar hemoglobina glicada. É uma resina com carga elétrica e as substancias com carga positiva ficam retidas.

Por afinidade: baseada na especificidade da substancias. Há três tipos de subst. Nas analises clinicas que usamos para esse método: enzimas (resina com substrato especifico para essa enzima); Hormônios (resina com receptores específicos); Anticorpo (resina com antígeno especifico).


[P.S.: VAI FICAR FALTANDO A QUARTA PARTE DO RESUMO]

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