Ácidos nucléicos:
DNA/RNA à polímeros de nucleotídeos. O DNA apresenta ácido desoxirribonucléico no segundo carbono e o RNA apresenta ácido ribonucléico, também no segundo carbono.
Um nucleotídeo é ligado ao outro através de ligações fosfodiéster. Os ácidos nucléicos apresentam-se com 5’------ >
Bases nitrogenadas:
Purinas à Adenina e Guanina, são as maiores e são cíclicas-duplas.
Pirimidinas à Citosina e Timina (ou Uracila no RNA), são menores e cíclicas-simples.
- O nucleotídeo do RNA tem um oxigênio e um H no carbono 2 e o do Dna tem apenas um H.
- O RNA tem a base uracila e o DNA tem a timina.
- A molécula de RNA é simples e a de DNA é dupla.
- A hidroxila do carbono 3, tanto do RNA quanto no DNA, é o local a partir do qual serão adicionados novos nucleotídeos durante a síntese de rna e dna.
- O DNA tem uma carga total negativa devido o grupamento fosfato na sua extremidade do lado externo, em contato com a água.
- O RNA é mais instável e fácil de degradar do que o DNA, pois, além de ser fita simples, a presença do oxigênio no carbono 2 o torna mais reativo com enzimas degradativas.
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE:
DNA recombinante: pode ser utilizado para construção de transgênicos, preparo de vacinas de DNA, na terapia gênica, na expressão de drogas recombinantes, etc.
Esquema de um DNA recombinante:
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (ER):
São endonucleases que clivam o DNA em locais específicos.
ENDONUCLEASE: clivam o DNA no interior da molécula. Elas podem ou não ser enzimas de restrição, isto é, toda ER é uma endonuclease mas nem toda endonuclease é uma ER.
EXONUCLEASES: clivam o DNA nas extremidades e não são consideradas enzimas de restrição. Exemplo: DNases (enzima que degrada DNA) e RNases (enzima que degrada RNA).
Endonuclease tipo I e III: clivam o Dna em locais não específicos.
Endonuclease tipo II: são as nossas endonucleases de restrição, pois clivam o DNA em seqüências restritas.
· Seqüência de reconhecimento: fragmento palindrômico contendo de 2 à 8 pares de base (1000 pb = 1 kb).
Palíndromo:
Ex: à à à
ARARA
ARARA
ß ß ß
Ex de seqüência palindromica no DNA:
------------------GAATTC-----------------
------------------CTTAAG-----------------
As seqüências especificas que são reconhecidas e clivadas pelas ER são apenas produzidas por bactérias (o DNA da bactérias é protegido contra essa enzima).
As bactérias protegem o seu DNA da clivagem, metilando-o no sítio de clivagem (a ER encontra o grupamento metil e não cliva a bactéria).
As bactérias criam essas ER com o intuito de clivar o DNA de bacteriófagos (vírus que infectam bactérias).
A ligação clivada pelas enzimas de restrição é a fosfodiéster, e isso pode ser revertido através de enzimas ligases.
As ER são dímeros, com isso elas conseguem clivar a duplas fita de DNA ao mesmo tempo.
TERMINAIS OU EXTREMIDADES:
São formados após a clivagem de um DNA.
Terminal protuberante/coeso/ligante: quando clivar a fita assimetricamente.
Terminal cego/abrupto: quando clivar no eixo de simetria.
Ferramentas da TDR:
VETORES DE CLONAGEM E EXPRESSÃO:
Vetor: aquele que transporta um pedaço de DNA de interesse para uma célula hospedeira desse DNA.
Aplicação: introduzir insertos em células vegetais (transgênico), em células humanas (terapia gênica), em células de bactérias ou leveduras (clonagem molecular).
Tipos: Naturais: bacteriófago e plasmídeo.
Artificiais: cosmídeo, Yac’s (cromossomo artificial de levedura), Bac’s (cromo. artif. De bactéria), vetores virais (adenovirus, retrovirus, etc), lipossomos.
Os vetores de expressão possuem as regiões regulatórias que permitem a expressão do gene para sintetizar proteínas. E os vetores de clonagem apenas permitem a clonagem de vários insertos.
Plasmídeo:
- deve ser pequeno (para comportar insertos maiores), e circular;
- deve possuir origem de replicação (ORI) local onde se inicia a replicação do DNA.
- deve possuir uma região contendo vários sítios de clivagem em um único local (Polulinker ou smc – sítio de múltipla clonagem)
- deve possuir o um gene para seleção de bactérias através de cor (LacZ)
- deve possuir pelo menos um gene de resistência à antbiótico (para permitir a seleção de bactérias recombinantes).
EX: no meu meio de cultura vou colocar as bactérias e o antibiótico, as bactérias com o plasmídeo e o gene resistente ao antibiótico vão ficar por lá e se proliferar, as que morrerem é porque não apresenta o gene resistente.
Gene LacZ está presente dentro do polylinker e esse gene codifica a beta-galactosidase (Enzima), essa enzima degrada o X-gal e isso faz com que a bactéria se torne azul.
As bactérias da minha colônia que apresentarem cor azul quer dizer que elas possuem o LacZ e que o inserto não foi inserido devidamente no centro do polylinker e do gene lacZ, isso quer dizer que eu não obtive sucesso com essas bactérias.
As bactérias que ficarem brancas significa que o inserto está no centro do polylinker e do LacZ, inativando o gene LacZ, com isso ele não sintetiza mais a enzima que degradaria o X-gal, ou seja, obtive o resultado esperado com essas bactérias.
AZUL à possui plasmídeo mas não o gene recombinante.
BRANCA à possui o clone recombinante = plasmideo + inserto.
Ao fazer uma reação de ligação, a reação poderá ser comprovada de suas maneiras:
-eletroforese em gel;
-através de reação de “transformação bacteriana”, esta permite selecionar os clones recombinante.
Em solução o DNA recombinante pode assumir diferentes conformações:
SUPERENOVELAMENTO;
RELAXADO;
SUPERRELAXADO.
Malha de agarose: formada por poros irregulares. O DNA superenrolado é mais fácil de se ligar nessa malha.
Se a reação não der certo, então o inserto e o vetor vão aparecer separados na eletroforese.
Transformação bacteriana:
- Introdução do DNA recombinante ou plasmideo reconstituído em uma bactéria.
Essa transformação pode ser por choque térmico ou choque elétrico.
CHOQUE TÉRMICO:
- banho maria a 42ºC por 2 minutos.
- gelo por 2 minutos.
- reação de ligação (adiciona imediatamente meio de cultura e manter a 37ºC sob agitação).
- bactérias competentes à preparadas quimicamente para serem transformadas. Devem ser mantidas a -80ºC.
Após 1 hora de agitação plaqueia-se a cultura em um meio sólido contendo antibiótico e uma substancia que muda de cor (branca para azul), corando as bactérias.
Resultado: Após o crescimento das colônias na placa --> tanto as bactérias azuis qunato as brancas são resistentes ao antibiótico. As brancas serão os meus clones recombinantes, e as azuis serão clones contendo apenas plasmideos.
CHOQUE ELÉTRICO:
O aparelho eletroporador vai emitir uma voltagem sobre a bactéria de 2.800 voltz. Este choque vai induzir a formar poros temporarios na parede celular da bacteria hospedeira. Dessa forma o DNA recombinante pode entrar na bactéroa. Após a adição de meio nutritivo a parede da bactéria se recupera.
Estrutura de vetores cosmidiais:
GENOMA BACTERIÓFAGO --> INTEGRA INSERTO BACTERIOFAGO --> MONTA O CAPSÍDEO NOVAMENTE --> OBTEM PARTICULAS DE BACTERIOFAGOS RECOMBINANTES, OU SEJA, GENOMA + INSERTO --> INFECTA BACTERIAS COM ELE (NÃO PRECISA DE CHOQUE TERMICO NEM ELETRICO).
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Elétroforese: técnica de sepação de macromoléculas utilizando uma matriz.
Matrizes: AGAROSE (polímero natural): visualização de DNA/RNA
Poliacrilamida (polímero sintético): vê DNA/RNA/proteínas
Gel de amidos (natural): puco utilizado
Polímeros sintéticos preenchem capilares na eletroforese capilar. (?)
Celulose: vê aminoácidos.
Os poros do gel de agarose são desordenados, ou seja, posso ter poros maiores e menores. Já os poros de um gel poliacrilamida são todos do mesmo tamanho. Portanto, o gel de agarose serve apenas para ver o tamanho e o de poliacrilamida dá pra ver tamanho e conformação.
"loading" de corrida: é misturado na amostra de RNA/DNA para dar coloração (azul de bromofenol).
brometo de etídeo: corante intercalante de DNA (se intercala entre os aneis planares do DNA).
o brometo de etideo corre em direção contraria do gel, ou seja, para o lado negativo e o DNA migra para o lado positivo.
A MIGRAÇÃO DOS FRAGMENTOS NO GEL É EM ESCALA LOGARÍTIMICA E NÃO ARITIMÉTICA.
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