quarta-feira, 16 de abril de 2008

Biologia Molecular - 1º Bimestre (Parte I)

Ácidos nucléicos:

DNA/RNA à polímeros de nucleotídeos. O DNA apresenta ácido desoxirribonucléico no segundo carbono e o RNA apresenta ácido ribonucléico, também no segundo carbono.

Um nucleotídeo é ligado ao outro através de ligações fosfodiéster. Os ácidos nucléicos apresentam-se com 5’------ > 3’, isto quer dizer que a ligação fosfodiéster ocorre entre a hidroxila no carbono 3 de um nucleotídeos e o grupamento fosfato no carbono 5 de outro. Esse ligação é o local de clivagem por uma enzima de restrição.

Bases nitrogenadas:

Purinas à Adenina e Guanina, são as maiores e são cíclicas-duplas.

Pirimidinas à Citosina e Timina (ou Uracila no RNA), são menores e cíclicas-simples.

- O nucleotídeo do RNA tem um oxigênio e um H no carbono 2 e o do Dna tem apenas um H.

- O RNA tem a base uracila e o DNA tem a timina.

- A molécula de RNA é simples e a de DNA é dupla.

- A hidroxila do carbono 3, tanto do RNA quanto no DNA, é o local a partir do qual serão adicionados novos nucleotídeos durante a síntese de rna e dna.

- O DNA tem uma carga total negativa devido o grupamento fosfato na sua extremidade do lado externo, em contato com a água.

- O RNA é mais instável e fácil de degradar do que o DNA, pois, além de ser fita simples, a presença do oxigênio no carbono 2 o torna mais reativo com enzimas degradativas.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE:

DNA recombinante: pode ser utilizado para construção de transgênicos, preparo de vacinas de DNA, na terapia gênica, na expressão de drogas recombinantes, etc.

Esquema de um DNA recombinante:

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (ER):

São endonucleases que clivam o DNA em locais específicos.

ENDONUCLEASE: clivam o DNA no interior da molécula. Elas podem ou não ser enzimas de restrição, isto é, toda ER é uma endonuclease mas nem toda endonuclease é uma ER.

EXONUCLEASES: clivam o DNA nas extremidades e não são consideradas enzimas de restrição. Exemplo: DNases (enzima que degrada DNA) e RNases (enzima que degrada RNA).

Endonuclease tipo I e III: clivam o Dna em locais não específicos.

Endonuclease tipo II: são as nossas endonucleases de restrição, pois clivam o DNA em seqüências restritas.

· Seqüência de reconhecimento: fragmento palindrômico contendo de 2 à 8 pares de base (1000 pb = 1 kb).

Palíndromo:

Ex: à à à

ARARA

ARARA

ß ß ß

Ex de seqüência palindromica no DNA:

------------------GAATTC-----------------

------------------CTTAAG-----------------

As seqüências especificas que são reconhecidas e clivadas pelas ER são apenas produzidas por bactérias (o DNA da bactérias é protegido contra essa enzima).

As bactérias protegem o seu DNA da clivagem, metilando-o no sítio de clivagem (a ER encontra o grupamento metil e não cliva a bactéria).

As bactérias criam essas ER com o intuito de clivar o DNA de bacteriófagos (vírus que infectam bactérias).

A ligação clivada pelas enzimas de restrição é a fosfodiéster, e isso pode ser revertido através de enzimas ligases.

As ER são dímeros, com isso elas conseguem clivar a duplas fita de DNA ao mesmo tempo.

TERMINAIS OU EXTREMIDADES:

São formados após a clivagem de um DNA.

Terminal protuberante/coeso/ligante: quando clivar a fita assimetricamente.

Terminal cego/abrupto: quando clivar no eixo de simetria.

Ferramentas da TDR:

VETORES DE CLONAGEM E EXPRESSÃO:

Vetor: aquele que transporta um pedaço de DNA de interesse para uma célula hospedeira desse DNA.

Aplicação: introduzir insertos em células vegetais (transgênico), em células humanas (terapia gênica), em células de bactérias ou leveduras (clonagem molecular).

Tipos: Naturais: bacteriófago e plasmídeo.

Artificiais: cosmídeo, Yac’s (cromossomo artificial de levedura), Bac’s (cromo. artif. De bactéria), vetores virais (adenovirus, retrovirus, etc), lipossomos.

Os vetores de expressão possuem as regiões regulatórias que permitem a expressão do gene para sintetizar proteínas. E os vetores de clonagem apenas permitem a clonagem de vários insertos.

Plasmídeo:

- deve ser pequeno (para comportar insertos maiores), e circular;

- deve possuir origem de replicação (ORI) local onde se inicia a replicação do DNA.

- deve possuir uma região contendo vários sítios de clivagem em um único local (Polulinker ou smc – sítio de múltipla clonagem)

- deve possuir o um gene para seleção de bactérias através de cor (LacZ)

- deve possuir pelo menos um gene de resistência à antbiótico (para permitir a seleção de bactérias recombinantes).

EX: no meu meio de cultura vou colocar as bactérias e o antibiótico, as bactérias com o plasmídeo e o gene resistente ao antibiótico vão ficar por lá e se proliferar, as que morrerem é porque não apresenta o gene resistente.

Gene LacZ está presente dentro do polylinker e esse gene codifica a beta-galactosidase (Enzima), essa enzima degrada o X-gal e isso faz com que a bactéria se torne azul.

As bactérias da minha colônia que apresentarem cor azul quer dizer que elas possuem o LacZ e que o inserto não foi inserido devidamente no centro do polylinker e do gene lacZ, isso quer dizer que eu não obtive sucesso com essas bactérias.

As bactérias que ficarem brancas significa que o inserto está no centro do polylinker e do LacZ, inativando o gene LacZ, com isso ele não sintetiza mais a enzima que degradaria o X-gal, ou seja, obtive o resultado esperado com essas bactérias.

AZUL à possui plasmídeo mas não o gene recombinante.

BRANCA à possui o clone recombinante = plasmideo + inserto.

Ao fazer uma reação de ligação, a reação poderá ser comprovada de suas maneiras:

-eletroforese em gel;

-através de reação de “transformação bacteriana”, esta permite selecionar os clones recombinante.

Em solução o DNA recombinante pode assumir diferentes conformações:

SUPERENOVELAMENTO;

RELAXADO;

SUPERRELAXADO.

Malha de agarose: formada por poros irregulares. O DNA superenrolado é mais fácil de se ligar nessa malha.

Se a reação não der certo, então o inserto e o vetor vão aparecer separados na eletroforese.

Transformação bacteriana:

- Introdução do DNA recombinante ou plasmideo reconstituído em uma bactéria.

Essa transformação pode ser por choque térmico ou choque elétrico.

CHOQUE TÉRMICO:

- banho maria a 42ºC por 2 minutos.

- gelo por 2 minutos.

- reação de ligação (adiciona imediatamente meio de cultura e manter a 37ºC sob agitação).

- bactérias competentes à preparadas quimicamente para serem transformadas. Devem ser mantidas a -80ºC.

Após 1 hora de agitação plaqueia-se a cultura em um meio sólido contendo antibiótico e uma substancia que muda de cor (branca para azul), corando as bactérias.

Resultado: Após o crescimento das colônias na placa --> tanto as bactérias azuis qunato as brancas são resistentes ao antibiótico. As brancas serão os meus clones recombinantes, e as azuis serão clones contendo apenas plasmideos.

CHOQUE ELÉTRICO:

O aparelho eletroporador vai emitir uma voltagem sobre a bactéria de 2.800 voltz. Este choque vai induzir a formar poros temporarios na parede celular da bacteria hospedeira. Dessa forma o DNA recombinante pode entrar na bactéroa. Após a adição de meio nutritivo a parede da bactéria se recupera.


Estrutura de vetores cosmidiais:
GENOMA BACTERIÓFAGO --> INTEGRA INSERTO BACTERIOFAGO --> MONTA O CAPSÍDEO NOVAMENTE --> OBTEM PARTICULAS DE BACTERIOFAGOS RECOMBINANTES, OU SEJA, GENOMA + INSERTO --> INFECTA BACTERIAS COM ELE (NÃO PRECISA DE CHOQUE TERMICO NEM ELETRICO).
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Elétroforese: técnica de sepação de macromoléculas utilizando uma matriz.
Matrizes: AGAROSE (polímero natural): visualização de DNA/RNA
Poliacrilamida (polímero sintético): vê DNA/RNA/proteínas
Gel de amidos (natural): puco utilizado
Polímeros sintéticos preenchem capilares na eletroforese capilar. (?)
Celulose: vê aminoácidos.

Os poros do gel de agarose são desordenados, ou seja, posso ter poros maiores e menores. Já os poros de um gel poliacrilamida são todos do mesmo tamanho. Portanto, o gel de agarose serve apenas para ver o tamanho e o de poliacrilamida dá pra ver tamanho e conformação.

"loading" de corrida: é misturado na amostra de RNA/DNA para dar coloração (azul de bromofenol).
brometo de etídeo: corante intercalante de DNA (se intercala entre os aneis planares do DNA).
o brometo de etideo corre em direção contraria do gel, ou seja, para o lado negativo e o DNA migra para o lado positivo.

A MIGRAÇÃO DOS FRAGMENTOS NO GEL É EM ESCALA LOGARÍTIMICA E NÃO ARITIMÉTICA.

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